题干
某种荧光蛋白（GFP）在紫外线或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1﹣GFP融合基因（简称甲），并将其插入质粒PO，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。 回答下列问题： （1）据图推断，该团队在将甲插入质粒PO时，使用了两种限制酶，这两种酶是 E1、E4 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 甲的完整 ，也是为了保证 甲与载体正确连接 。 （2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色的荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 转录 和 翻译 过程。 （3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的 细胞核 移入牛的 去核卵母细胞 中，体外培养，胚胎移植等。 （4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 核DNA （填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
解析（含参考答案）
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 解：（1）该团队在将甲插入质粒PO时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1、E4，使用这两种酶进行酶切可以保证目的基因两端有启动子和终止子，可以保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。 （2）在该细胞中观察到了绿色的荧光，检测到了基因表达的产物，可以说L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。 （3）为了获得含有甲的牛，该团队可以利用细胞核移植技术，将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，体外培养，胚胎移植等。 （4）克隆牛利用的是细胞核移植技术，遗传物质来自于细胞核，所以用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA 作为PCR模板。 故答案为： （1）E1、E4 甲的完整 甲与载体正确连接 （2）转录 翻译 （3）细胞核 去核卵母细胞 （4）核DNA 本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生运用所学基础知识，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。 形式 自由水 结合水 定义 细胞中绝大部分的水以游离的形式存在，可以自由流动 与细胞内的其他物质相结合的水 含量 约占细胞内全部水分的95% 约占细胞内全部水分的4.5% 功能 ①细胞内良好的溶剂 ②参与生化反应 ③为细胞提供液体环境 ④运送营养物质和代谢废物 是细胞结构的重要组成成分 联系 自由水和结合水能够随新陈代谢的进行而相互转化 自由水和结合水能够随新陈代谢的进行而相互转化 垂体 生长激素 蛋白质 全身 促进生长，促进蛋白质合成和骨生长 垂体 促甲状腺激素 蛋白质 甲状腺 控制甲状腺的活动 垂体 促性腺激素 蛋白质 性腺 控制性腺的活动 消毒 灭菌 概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子） 常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等