题干
UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和________三步。 （2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是________（答出2点）。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 （3）我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是________。 （4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加_________，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是________；在第二次筛选培养基中添加________。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是________（填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并________。
答案
（1）延伸 （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 （4） ①. 庆大霉素 ②. pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长 ③. 蔗糖 ④. ② ⑤. 测序
解析
PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接。 在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此类设计的主要目的是防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染。 据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活；筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是②，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并测序来鉴定。
果实含水量/% 温度/℃ O2体积分数/% 湿度/%
约85 13 24 90~95
植被类型 海拔/m 杜鹃花属物种数
常绿阔叶林 2000～3000 8
寒温性针叶林 3000～4300 57
寒温性灌丛 3200～4400 56
高山草甸 4200～4500 30
温度/℃ 28 34 38
光照下CO2吸收速率/（μmol·m-2·s-1） 22.52 23.41 24.15
黑暗下CO2释放速率/（μmol⋅m-2·s-1） 3.26 4.56 5.59
组别 注射药剂
甲 生理盐水
乙 PD-L1抗体
丙 化疗药物A
丁 ADC