题干
肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 （1）培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液______异常；乳腺癌细胞培养时______（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是______。 （2）P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为______（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是______。 （3）S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因______S基因的转录，______（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。
答案
（1） （2） ①. ③④ ②. 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 （3） ①. 抑制 ②. 促进
解析
动物细胞培养中，CO₂的作用是维持培养液正常的pH，若CO₂不足会导致培养液pH异常；乳腺癌细胞是癌细胞，细胞膜上糖蛋白减少，失去了接触抑制特性，因此培养时不会出现接触抑制；胰蛋白酶处理贴壁细胞分散细胞时，处理时间过长会过度分解细胞蛋白、损伤细胞，因此需要控制处理时间。 构建重组质粒时，需要保证目的基因插入方向正确：质粒启动子在插入位点左侧，转录方向从左到右，而P基因自身转录方向向左，因此需要将P基因的右端（转录起点侧）连接靠近启动子的Bgl II位点，左端连接靠近终止子的Hind III位点，但因质粒的复制原点有Hind III的酶切位点，在启动子和复制原点之间还有BamH I的酶切位点，故只能选择Bgl II作为靠近启动子的酶切位点、Spe I作为靠近终止子的酶切位点。根据碱基互补配对，Bgl II识别序列为AGATCT，P基因右端序列匹配引物③（5'-AGATCTAGGCAT-3'）；Spe I识别序列为ACTAGT，P基因左端序列匹配引物④（5'-ACTAGTCCGTGT-3'），因此选引物③④。 本实验探究P基因的作用，实验组导入含P基因的重组质粒，对照组需要排除质粒本身的影响，因此对照组为转入不含P基因的空质粒的乳腺癌细胞，其余条件与实验组一致。 启动子甲基化会阻碍RNA聚合酶与启动子结合，因此P蛋白诱导S基因启动子甲基化，会抑制S基因的转录；S基因的作用是抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖，S基因表达被抑制后，DNA损伤修复可以正常进行，因此会促进肿瘤耐药。 植物 根孢囊霉 生物量/（g·株-1） 叶片磷含量/（mg·株-1） 菊 不接种 2.52 0.81 菊 接种 3.21 2.05 松 不接种 0.63 0.11 松 接种 0.48 0.09