题干
小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是_______。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是___________________________________________________________________________________。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。
答案
（1） （2）Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ （3） ①. DNA聚合酶、DNA连接酶 ②. 不需要 ③. 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 （4）抗原-抗体杂交
解析
启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ 。 由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 基因a 单链DNA ……TAC ATT TNA CCA GTA…… 基因A 单链DNA ……TAC ATT TGA CCA GTA…… 基因A mRNA ……AUG UAA ACU GGU CAU…… 基因A 多肽 ………… 菌株 a b c d 菌落直径与透明圈直径的比值 0.5 0.3 0.5 0.7 实验处理 现象 花粉刺激 喘息、咳嗽 阻断a点后，花粉刺激 无喘息、无咳嗽 阻断b点后，花粉刺激 喘息、无咳嗽