题干
平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。
- ABamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb
- BBamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
- CHindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb
- DHindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
答案
（1） （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 （3）安全性
解析
农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV切割产生平末端，T4 DNA连接酶可以连接平末端，连接效率高于EcolDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamHI/EcoRI酶切得到0.7kb+6.1kb（6.8−0.7=6.1）；HindIII/EcoRI酶切得到1.1kb+5.7kb（6.8−1.1=5.7），因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。 根据题干和表格数据，转入Tps基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50更短，最终第7天死亡率更高。 转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 组别 实验设计 实验结果 结果分析 ① 测定突变体和野生型玉米种子中的脱落酸含量 突变体脱落酸含量与野生型一致 突变体脱落酸受体功能正常 ② 测定突变体和野生型玉米种子中的脱落酸含量 突变体脱落酸含量低于野生型 突变体脱落酸受体功能异常 ③ 给突变体玉米果穗施加适宜浓度的脱落酸溶液 果穗上种子不发芽 突变体脱落酸受体功能正常 ④ 给突变体玉米果穗施加适宜浓度的脱落酸溶液 果穗上种子发芽 突变体脱落酸合成受抑制 相关指标 总枝条位置 叶片最大光合速率 （CO2μmol·m-2·s-1） 叶片呼吸速率 （CO2μmol·m-2·s-1） 相对碳成本 （%） 比叶面积 （m2·kg-1） 树冠顶部 11.9 1.8 15.6 9.8 树冠底部 9.5 1.1 15.2 13.5 组别 处理方法 T1 种植旱稻 T2 在旱稻田周围种植万寿菊 T3 对旱稻喷洒万寿菊提取物 T4 在旱稻田周围种植万寿菊且对旱稻喷洒万寿菊提取物 相关指标 培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3